2025年6月1日，貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士生楊玉嬡作為第一作者，宋寶安院士作為通訊作者，在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Journal of Advanced Research(中科院一區(qū)TOP，Impact Factor = 11.4，CiteScore = 21.6)上在線(xiàn)發(fā)表“Antiviral activity and mechanism of purine morpholine nucleoside analogues incorporating a sulfonamide fragment”為題的研究論文。團(tuán)隊(duì)以嘧啶核苷和嘌呤核苷作為核心母體結(jié)構(gòu)，通過(guò)引入磺胺基團(tuán)作為藥效團(tuán)，設(shè)計(jì)并高效合成了兩類(lèi)新型核苷類(lèi)衍生物：64個(gè)磺胺取代嘧啶核苷類(lèi)衍生物和38個(gè)磺胺取代嘌呤核苷類(lèi)衍生物，成功發(fā)現(xiàn)磺胺結(jié)構(gòu)單元的嘌呤嗎啉核苷類(lèi)小分子抑制劑C1。機(jī)制研究揭示了其通過(guò)靶向PMMoV CP 13位的酪氨酸殘基(Tyr13)，抑制I3QHX5(Adenosylhomocysteinase)與PMMoV CP之間形成的相分離，對(duì)凝聚體具有破壞作用，從而干擾了病毒粒子的形成，實(shí)現(xiàn)抗辣椒輕斑駁病毒的目的。研究獲得了國(guó)家基金重點(diǎn)項(xiàng)目(32330087)的支持。

　　辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottled virus, PMMoV)是一種RNA病毒，是辣椒作物中最具破壞性的病原體之一，由于其高傳染性和在土壤中穩(wěn)定存在，這種病毒作為水生環(huán)境和水處理系統(tǒng)中人類(lèi)糞便污染的潛在病毒指示物越來(lái)越引起人們的關(guān)注。最新研究表明，PMMoV在糞便中的檢出率與宿主特異性免疫應(yīng)答存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，揭示該病毒可能對(duì)人類(lèi)健康具有潛在致病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于PMMoV在污染種子、植物殘?bào)w、土壤及水體中表現(xiàn)出極強(qiáng)環(huán)境穩(wěn)定性，其對(duì)生態(tài)安全、食品安全及公共健康的潛在威脅正受到日益廣泛的關(guān)注。當(dāng)前針對(duì)PMMoV的防控策略主要依賴(lài)抗病品種篩選，缺乏有效防治該病毒的藥劑。因此，基于天然產(chǎn)物設(shè)計(jì)，合成出一種高效、低毒、環(huán)境友好的抗病毒劑來(lái)抑制PMMoV并揭示其分子靶標(biāo)具有重要的意義。

　　胞嘧啶核苷類(lèi)藥物是對(duì)天然核苷(酸)的堿基或糖基部分進(jìn)行修飾，或者同時(shí)對(duì)堿基和糖基進(jìn)行雙重修飾，可得到核苷類(lèi)似物或核苷酸類(lèi)似物。近十多年來(lái)，嘧啶類(lèi)核苷抗病毒藥物發(fā)展迅速，以胞嘧啶為中間體創(chuàng)新出抗病毒活性的化合物不計(jì)其數(shù)，它具有廣泛的抗病毒活性，如HIV，HCV，H5N5，HCMV，DENV等。同樣，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，胞嘧啶核苷類(lèi)藥物類(lèi)衍生物也展現(xiàn)出了抗病毒生物活性，嘧肽霉素和寧南霉素均成為抗病毒劑代表品種。然而，盡管核苷類(lèi)藥物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，但關(guān)于其抗植物病毒的創(chuàng)新研究卻仍然相對(duì)較少。

　　該研究聚焦于PMMoV，以醫(yī)藥及農(nóng)藥領(lǐng)域具有廣泛生物活性的胞嘧啶核苷和嘌呤核苷為先導(dǎo)化合物，基于活性片段拼接策略，通過(guò)引入磺胺結(jié)構(gòu)單元，設(shè)計(jì)并合成了2個(gè)系列含磺胺結(jié)構(gòu)單元的胞嘧啶核苷類(lèi)衍生物及1個(gè)系列含磺胺結(jié)構(gòu)單元的嘌呤核苷類(lèi)衍生物。即2-(乙酰氧基甲基)-6-(5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類(lèi)衍生物(A)、2-(乙酰氧基甲基)-6-(8-取代-5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類(lèi)衍生物(B)和2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-取代-6-嗎啉基-9H-嘌呤-9-基)-5-((取代苯基)磺酰胺基)四氫-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯類(lèi)衍生物(C)。以寧南霉素為對(duì)照藥劑，采用半葉枯斑法，測(cè)試了含磺胺結(jié)構(gòu)單元的胞嘧啶核苷類(lèi)衍生物A1-A32、含磺胺取代的胞嘧啶核苷類(lèi)衍生物B1-B32、含磺胺結(jié)構(gòu)單元的嘌呤核苷類(lèi)衍生物C1-C38對(duì)PMMoV的抑制活性，研究發(fā)現(xiàn)化合物C1對(duì)PMMoV表現(xiàn)優(yōu)異的抑制活性，其EC50值為37.0 μg/mL，優(yōu)于對(duì)照藥劑寧南霉素(68.9 μg/mL)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，化合物C1與PMMoV CP具有優(yōu)異的結(jié)合力，其Kd值為1.50 μM，優(yōu)于對(duì)照藥劑寧南霉素(13.59 μM)。為了深入探究目標(biāo)化合物抗PMMoV的作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)以C1為模型化合物，通過(guò)在嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)中引入炔基基團(tuán)，成功合成小分子探針化合物C2?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明，C2對(duì)PMMoV的抑制活性與C1相當(dāng)，且均優(yōu)于對(duì)照藥劑寧南霉素，表明C2可作為小分子探針用于靶蛋白捕獲。通過(guò)ABPP、濃度依賴(lài)性及競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)及MST分析，明確PMMoV CP為C1的直接作用靶標(biāo)。進(jìn)一步通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)篩選C1作用在PMMoV CP上的關(guān)鍵作用位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)C1與PMMoV CP相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為13位和140位的酪氨酸(Tyr13、Tyr140)。為解析這兩個(gè)位點(diǎn)在病毒侵染過(guò)程中的功能，構(gòu)建了pCB-GFP-PMMoV CP^Y13A和pCB-GFP-PMMoV CP^Y140A的侵染性克隆，通過(guò)Western blot和RT-qPCR技術(shù)，分別檢測(cè)其CP蛋白及CP基因在7、14及21 dpi時(shí)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Tyr140突變?yōu)楸彼?Y140A)可延緩病毒的系統(tǒng)侵染進(jìn)程，而Tyr13突變?yōu)楸彼?Y13A)則顯著抑制病毒的系統(tǒng)侵染，表明PMMoV CP第13位氨基酸的改變對(duì)病毒侵染過(guò)程具有決定性影響?；谏鲜鲫P(guān)鍵發(fā)現(xiàn)，本研究擬通過(guò)Co-IP MS及RNA-seq，分析PMMoV CP野生型與Y13A突變體在互作蛋白層面的差異，以期闡明導(dǎo)致兩者侵染表型差異的分子機(jī)制。

圖1 C1靶向PMMoV CP 13位的酪氨酸殘基，抑制I3QHX5與PMMoV CP之間的相分離

　　基于RT-qPCR技術(shù)對(duì)Co-IP MS及RNA-seq篩選獲得的蛋白進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證，成功鑒定出5個(gè)候選蛋白(A0A248QEL2、B1PSM0、I3QHX5、LOC109221810、A2IBL2)。為解析PMMoV CP與PMMoV CP^Y13A在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的差異，采用LCA及BiFC進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證。LCA結(jié)果表明，PMMoV CP與PMMoV CP^Y13A均能與上述5個(gè)候選蛋白發(fā)生互作；而B(niǎo)iFC分析表明，僅A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5可與PMMoV CP和PMMoV CP^Y13A形成特異性互作，而LOC109221810與A2IBL2未檢測(cè)到熒光信號(hào)。值得關(guān)注的是，盡管PMMoV CP和PMMoV CP^Y13A均能與A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5互作，但在與I3QHX5的互作過(guò)程中呈現(xiàn)顯著差異：PMMoV CP與I3QHX5互作時(shí)誘導(dǎo)形成大量生物分子凝聚體，而PMMoV CP^Y13A與I3QHX5互作則無(wú)凝聚體產(chǎn)生。通過(guò)融合-裂變動(dòng)態(tài)觀察及FRAP技術(shù)分析，證實(shí)PMMoV CP與I3QHX5形成的凝聚體在體內(nèi)外均具備LLPS特性，而PMMoV CP^Y13A喪失了誘導(dǎo)LLPS的能力，提示該凝聚體可能參與病毒侵染促進(jìn)過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在30、36及42 hpi添加小分子化合物C1，可顯著影響PMMoV CP，PMMoV CP^Y13A與I3QHX5的互作效率及凝聚體形成數(shù)量。Western blot及RT-qPCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，沉默I3QHX5導(dǎo)致PMMoV CP蛋白積累量及病毒RNA水平顯著降低，表明I3QHX5是病毒復(fù)制的正調(diào)控因子，PMMoV可通過(guò)調(diào)控該蛋白促進(jìn)自身增殖。上述結(jié)果共同表明，C1發(fā)揮抗病毒活性的分子機(jī)制可能與抑制CP介導(dǎo)的LLPS凝聚體形成密切相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為解析病毒利用宿主相分離機(jī)制完成生命周期提供了新視角，并進(jìn)一步支持靶向CP介導(dǎo)的LLPS作為抗病毒策略的合理性。

圖2 化合物C1抑制PMMoV復(fù)制的可能作用機(jī)制模式圖

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